轉基因蔬菜研究的進展

http://www.bioon.com/bioindustry/foods/342879.shtml

來源 上海科教興農網 2007-11-6

轉基因蔬菜研究的進展
 

2009年，國內生物醫藥的突破之年。不僅有干細胞發現的新突破，還有轉基因作物政策的新舉措。

摘要：利用DNA重組技術將目的基因轉入蔬菜中，培育成的蔬菜稱為轉基因蔬菜。它主要是用來選育具有特殊性狀的蔬菜新品種。通過轉基因技術人們能最大限度地利用感興趣的外源基因。使蔬菜育種工作具有更強的針對性。本文綜述了轉基因蔬菜在抗病毒、抗蟲、抗除草劑、延遲成熟及品質改良等方面的進展和現狀，展示了基因轉化技術在蔬菜品種改良上廣闊的應用前景。

　關鍵詞：蔬菜：轉基因

　生物技術為培育高產、高抗、多抗、優良的新品種提供了科學的手段，特別是轉基因蔬菜的研究，為蔬菜育種、病蟲害防治及品種改良做出了巨大貢獻。蔬菜轉基因育種就是將轉基因技術應用于蔬菜改良。蔬菜基因工程是在重組DNA技術上發展起來的一門新技術，它以分子遺傳學理論為基礎，綜合了分子生物學、微生物學和植物組織培養等現代技術和方法，將外源目的基因經過或不經過修改，通過生物、物理或化學的方法導人蔬菜，以改良其性狀，得到優質、高產、抗病蟲及抗逆性強的蔬菜新品種。

　世界上第一個商業化的轉基因植物品種就是轉基因蔬菜，也就是1994年美國Calgene公司推出的轉基因耐貯番茄品種FlawSaw，它是通過分離一個與乙烯代謝有關的氨基環丙烷羧酸(ACC)合成酶基因然后再將其反向(反義)導人番茄。從而抑制乙烯的合成，其果實長期保持綠色硬實，易于運輸和貯藏。

   由于在一些蔬菜作物上建立了比較成熟的再生和轉化系統，因而蔬菜作物的遺傳轉化進展較快。到目前為止，已進行轉基因并獲得轉基因植株的蔬菜有番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、菠菜、生菜、甘藍、花椰菜、大白菜、油菜、黃瓜、西葫蘆、豇豆、豌豆、茄子、辣椒、洋蔥、石刁柏、芥菜等。所改良的農藝性狀包括抗病、抗蟲、抗除草劑、延熟保鮮及其它品質的改良等。所采用的轉化方法有農桿菌介導的轉化方法和DNA直接轉移法，后者又包括PEG法、電擊法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、脂質體法等。

　1. 抗病毒基因的轉化

　植物病害主要分為細菌病害、真菌病害和病毒病三類。病毒病一直是蔬菜生產最主要的病害之一，采用常規育種方法結合使用殺菌劑雖然取得了一定的成效，仍不能徹底解決病害問題且常規育種方法周期長，抗性資源有限，另外，大量使用殺菌劑除對蔬菜品質影響外，對環境也造成污染。隨著現代分子生物學的發展及轉基因技術的日益完善，為培育抗病品種，有效改良蔬菜提供了一條全新的途經。通過克隆與抗病有關的基因導入植物體內，提高作物的抗病性。

  目前，已獲得許多抗病的工程植物。利用最多的一種方法是通過遺傳轉化將病毒外殼蛋白(CoatProtein，CP)編碼基因轉入受體細胞表達，這些病毒外殼蛋白在植物細胞中的積累，能夠抑制侵染病毒的復制，從而減輕癥狀或推遲病毒發生的時間。Powell等利用此方法首次將煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因轉入番茄獲得了大量抗病毒番茄植株。這一方法被迅速應用于其它病毒和植物，至今已克隆了至少15個病毒組的3O種病毒的cp基因，并成功地轉化了20多種植物，轉基因植物對相應病毒均表現出不同程度的抗性。

   此外，病毒復制酶基因、病毒的反義RNA基因、病毒的衛星RNA及一些非病毒來源的基因，目前均有很大發展。宋艷如等構建了PVX+PVY+PLRV(卷葉病毒)雙價外殼蛋白基因的表達載體，轉化馬鈴薯并獲得了轉基因植株。

  1992年我國成功克隆黃瓜花葉病毒蛋白基因，建立良好的載體系統，并將其轉入番茄品種內，首次獲得抗黃瓜花葉病毒轉基因番茄新植株。李華平等將黃瓜花葉病毒衣殼蛋白基因轉入辣椒，獲得了轉基因植株。王慧中等通過農桿菌介導法將外源的西瓜花葉病毒2號(WMV-2)CP基因導入黃瓜，轉基因的黃瓜已開花結果并獲得子一代植株。轉基因子一代植株對WMV-2表現出較強的抗性。

   畢玉平等構建了TMVcp和CMVcp雙價植物載體，轉化番茄，獲得再生植株。通過點雜交、PCR檢測和Southern雜交證實為轉基因植株，且比對照植株表現出明顯的抗性。郭亞華等利用發根農桿菌的Ri質粒介導的二元載體，將TMV．cp和CMV-cp基因導入甜椒中，經PCR、ELISA檢測證明這兩個基因導入甜椒植株并已表達。

   盧愛蘭等以子葉柄為材料，通過農桿菌介導，將表達載體中蕪菁花葉病毒基因導入甘藍型油菜，并獲得具有不同程度抗性的植株。現在人們利用外殼蛋白基因已獲得的抗病毒蔬菜有：抗ALMV番茄、抗PVS馬鈴薯、抗CMV辣椒、黃瓜、馬鈴薯、番茄、甜瓜、抗WMVSMV大豆、甜瓜、馬鈴薯、番茄等。

　此外，能分解真菌細胞壁的幾丁質酶、β-1，3葡聚糖酶基因、病程相關蛋白基因、溶菌酶基因的分離、克隆、表達的研究，將為蔬菜抗細菌和真菌病基因工程及抗病育種提供更多的選擇。

　2. 抗蟲基因的轉化

　蟲害是蔬菜生產中的嚴重問題用常規的育種方法很難育成較好的抗蟲品種。植物抗蟲基因工程的誕生，為防治害蟲提供了一條嶄新的途徑。目前應用最廣泛的抗蟲基因主要有兩種，即來源于蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白(簡稱Bt．toxin)基因和來源于植物的蛋白酶抑制劑因子(p1)基因。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt基因產物對鱗翅目昆蟲有很強的毒殺效力，是目前世界上應用最廣泛的抗蟲基因。

    蛋白酶抑制劑是一類存在于某些植物中的蛋白質，它能抑制昆蟲或動物消化系統的蛋白酶活性，對植物起著天然保護作用。豇豆的胰蛋白酶抑制劑(簡稱CpTI)被認為是最有效的蛋白酶抑制劑。它具有廣譜抗蟲性，對鱗翅目、鞘翅目及直翅目的許多昆蟲都有毒殺活性。目前已轉基因抗蟲蔬菜有番茄、馬鈴薯、青花菜、花椰菜、小白菜、油菜等。

  1987年，Fischhoff等首次獲得了轉Bt基因的番茄。Iannacone等將Btcry3基因進行改造，去除了影響表達不穩定元件，選用了植物偏愛的密碼子，極大地提高了毒蛋白的表達水平，獲得了高抗鞘翅目甲蟲的茄子。李學寶等。通過油菜子葉外植體一農桿菌共培養法將蘇云金桿菌殺蟲蛋白基因導入甘藍型油菜，獲得抗蟲的轉基因植株。部分轉基因植株具有明顯的殺蟲活力，用轉基因植株葉片飼喂甜菜夜蛾幼蟲后，幼蟲出現中毒癥狀，導致幼蟲發育受阻和死亡。

   方宏筠等¨將豇豆胰蛋白酶(cp．TI)基因導入甘藍栽培品種“京豐”和“迎春”，獲得抗菜青蟲的轉基因甘藍。張七仙等將CpTI基因導入甘藍，轉基因植株對小菜蛾具有明顯抗性且外源基因轉化率高達20％。梁小友等以農桿菌介導轉化番茄，將CMV—cp基因和Bt—toxin基因同時導入轉化再生的番茄植株。RNA點雜交證明CMV．cp基因和Bt—toxin基因已在轉基因番茄植株中同時獲得表達。

　3. 抗除草劑基因的轉化

　在進行除草劑抗性的基因工程時，有兩條途徑可供選擇：一是修飾除草劑作用的靶蛋白(herbicidetargetprotein)，使其對除草劑不敏感，或促其過量表達以使植物吸收除草劑后仍能進行正常代謝；二是導入外源基因使除草劑發生作用前將其降解或解毒。目前來源于潮濕鏈霉菌的bar基因應用較多，此基因編碼的蛋白可將除草劑PPT乙酰化，使其失去毒力，bar基因已被轉入番茄和油菜等作物中。美國已大面積推廣應用耐除草劑的大豆品種。彭仁旺等以油菜子葉柄為受體，通過農桿菌介導的遺傳轉化，經Northernblot等檢測，barstar基因及bar基因在轉基因植物中得到正確的調控與表達。

　4. 抗逆基因的轉化

　抗逆基因工程的研究主要集中在逆境條件下才能表達的某些基因的研究以及抗逆代謝過程中某些酶的研究。現在已分離出大量與抗逆代謝相關的基因。如與抗凍有關的鰈魚的抗凍蛋白(AFPs)、抗凍糖蛋白(AFGPs)及昆蟲的溫衡蛋白。與抗旱有關的基因，如肌醇甲基轉移酶基因(Imil)、繭蜜糖合成酶基因等。與抗鹽有關的基因，如脯氨酸合成酶(proA)、山菠菜堿脫氫酶(BADH)、磷酸甘露脫氫酶(milD)基因等。

   李銀心等¨糾將山菠菜堿醛脫氫酶(BADH)基因經根癌土壤桿菌介導轉入豆瓣菜，轉基因植株能夠在0．5％Nacl培養基上正常生長，而對照在相同的培養基上生根困難且生長緩慢。美國的Hightower等將鰈魚科的抗凍基因轉入番茄和煙草中，發現具有抑制冰塊重新結冰的能力，這一結果給冰凍保鮮蔬菜展示了誘人前景。

　5. 延遲成熟及其它品質改良

　乙烯控制著植物的許多生理和發育過程，如果實成熟、脫落、和衰老等通過克隆對乙烯生物合成過程中的ACC合成酶基因并轉入植物來調節植物體內的乙烯合成，從而影響乙烯參與的多種生理過程。如控制果實的成熟時間，達到延遲成熟，延長保鮮期，提高耐貯藏性。湯富強等Ⅲ進行了ACC合成酶基因及其反義基因轉基因番茄植株的獲得及其部分生理特性的研究。

    王春霞等以西瓜無菌苗子葉為外植體，經根癌農桿菌進行葉盤共培養，將NptlI基因和番茄的ACC合成酶基因及其反義基因轉入西瓜。Southernblot結果證明獲得轉基因植株，乙烯釋放指標表明轉入的正義和反義ACC合成酶基因得到不同程度的表達。ACC解氨酶可通過抑制乙烯的產生，來達到延緩衰老，保持新鮮的目的。李賢等利用農桿菌介導，以下胚軸為外植體把ACC解氨酶基因轉入青花菜栽培品種獲得了轉基因再生植株。

　目前，蔬菜品質改良是蔬菜育種的主要目標之一。將一些有價值的外源基因導入蔬菜，對改良蔬菜品質也是大有作為的。將種子特異性啟動子控制的硬脂酸去飽和酶反義基因導入油菜，以控制發育階段的油菜籽硬脂酸乙酰載體蛋白去飽和酶活性使轉基因油菜籽硬脂酸的含量上升幾十倍。

    Stark等獲得一種同源四聚體AGPase基因，該基因連接質體轉運肽基因和馬鈴薯塊莖特異表達的啟動子后轉化馬鈴薯，得到的轉基因馬鈴薯淀粉較對照增加35％，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例確定食品的加工品質，基因工程可以改變這種比例。王光清等利用農桿菌介導的葉盤共培養法將npt基因和玉米醇溶蛋白基因(zein)與HEAAE融合基因導人馬鈴薯品種“東農303”，證明整合與表達。李雷等將玉米

　1Oku醇溶蛋白基因在轉基因馬鈴薯塊莖中得到表達。氣生塊莖和大田塊莖的氨基酸分析表明，轉基因馬鈴薯塊莖中含硫氨基酸含量有明顯提高。呂德揚等通過農桿菌介導法也將含硫氨基酸蛋白基因轉入苜蓿，成功地誘導轉基因植株再生。劉敬梅等刮以萵苣子葉為外植體，經農桿菌介導，成功地進行了馬檳榔甜蛋白基因MBLII對萵苣的遺傳轉化。鄭回勇等將人乳鐵蛋白基因插入pBIN121質粒Xba、Sac之間，經農桿菌介導轉入胡蘿1-受體，經PCR檢測，初步確定抗性植株為轉入乳鐵蛋白基因植株。

　6. 展望

　基因工程方法改良蔬菜品種成果顯著，并在蔬菜遺傳育種，品種改良上的前景十分誘人。但存在轉化成功作物品種少，轉化率不高，結果不穩定等問題。今后研究的重點應放在開發較多的有重要價值的目的基因，完善轉化技術，以達到蔬菜改良的目的。

　作者：陶雷吳瑩東北林業大學

　袁紅梅大慶師范學院

　趙麗娟黑龍江省農科院作物育種所

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